Fluoresceinisotiocyanat , vanligen kallad FITC - uttalas " fit - c , " för att rimma med " ditsy " - är en fluorescerande markör som är kemiskt bundet , eller konjugerade till andra molekyler som proteiner och antikroppar . En antikropp konjugerad med FITC kan också hänvisas till som en " FITC-märkt antikropp. " FITC exciteras av ljus vid en våglängd av 488 nm, och avger fluorescensenergi detekterades vid 530 nm. En forskare kan se det med ett fluorescerande mikroskop eller använda utrustning som detekterar de fluorescerande utsläpp och registrerar dem . Metoder
FITC konjugering följer en grundläggande protokollet . Till exempel skulle FITC och en antikropp blandas samman vid ett visst förhållande i ett provrör och roterades vid rumstemperatur under en timme. För att ta bort obunden FITC från lösningen , hälls den på en affinitetskromatografikolonn - ett glasrör fyllt med en pärlliknande gel som kommer att binda den okonjugerade FITC. Under tiden kommer den FITC - märkta antikroppen strömma genom kolonnen och samlas för användning .
Överväganden
Innan en konjugation , bör forskaren överväga flera punkter . Först är FITC mycket instabil och bör inte utsättas för ljus - det bör hållas i folietäckt - rör vid alla tidpunkter . Andra kan konjugering tid och temperatur måste ändras för en temperaturkänslig protein. Slutligen kan olika proteiner och antikroppar har olika FITC - bindande kapacitet , så att hitta rätt förhållande av antikropp till FITC är kritisk , för lite FITC gör en antikropp omätbara och för mycket kan ändra dess specificitet . Av denna anledning bör preliminära småskaliga konjugationer vid olika förhållanden av FITC till antikropp inrättas parallellt. När det optimala förhållandet är etablerad , kan den storskaliga konjugering utföras .
Använder
Läkare och forskare använder FITC - märkta antikroppar , hormoner och tillväxtfaktorer faktorer i en mängd olika analyser och tillämpningar. Till exempel har en stamcell som finns i blodet en molekyl på sin yta som kallas CD34 . En laboratorietekniker kan blanda en patients blod med en FITC - märkt antikropp specifik för CD34 , och kör cellerna genom en flödescytometer som använder en laserstråle för att göra FITC fluorescerar . Därefter separerar cytometer de fluorescerande CD34 celler från resten av blodceller , och läkarna kan använda dessa isolerade stamceller i terapeutiska behandlingar .
